Поиск

Вход на сайт

Категории раздела

Острый парапроктит [5]
Среди проктологических заболеваний одно из ведущих мнст занимает парапроктит.

Календарь

«  Май 2017  »
ПнВтСрЧтПтСбВс
1234567
891011121314
15161718192021
22232425262728
293031

Статистика


Онлайн всего: 1
Гостей: 1
Пользователей: 0

Медицинская энциклопедия   Э  Ю  Я  У  Х  Ц


     ЭЛЕКТРОННАЯ  МИКРОСКОПИЯ

   Электронная микроскопия— метод морфологического исследования объектов с помощью потока электронов, позволяющий изучать  структуру этих объектов на макромолекулярном и субклеточном уровнях.

     После выпуска первой промышленной модели просвечивающего (трансмиссионного) электронного микроскопа  электронная микроскопия прошла большой, путь развития и позволила перейти на качественно новый уровень изучения материи. Электронная микроскопия нашла широкое применение в морфологии, микробиологии, вирусологии, биохимии, онкологии, медицинской генетике, иммунологии. Благодаря электронная микроскопия раскрыта субмикроскопическая структура клеток, открыт ряд неизвестных ранее клеточных органелл, таких как лизосомы, рибосомы, эндоплазматический ретикулум, микротрубочки, цитоскелет, структуры, специфичные для отдельных видов клеток ( Клетка). Электронная микроскопия  позволила понять многие тонкие механизмы развития болезней, в т. ч. на ранних этапах их возникновения, еще до появления четкой клин, симптоматики.

   Электронная микроскопия все шире применяется для ранней диагностики- заболеваний, а также для выявления этиологии инф. процессов. Ее используют в онкологии для определения гистогенеза опухолей, что имеет важное значение в лечении и прогнозе онкол. заболевания. В нефрологии исследование с помощью Э. М. материала, полученного при пункционной биопсий, позволяет выявить ранние морфол. изменения структур почек, диагностировать форму гломерулонефрита  и т. п. При электронная микроскопия пунктатов печени удается провести дифференциальную диагностику гепатитов (Гепатит), гепатозов и других заболеваний печени, определить активность процесса и нередко его этиологию.

   Исследования строения материи на субклеточном и макромолекулярном уровнях сдерживаются возможностями разрешающей способности электронных микроскопов ( Электронный микроскоп). Использование электронная микроскопия — метод морфологического исследования объектов с помощью потока электронов, позволяющий изучать  структуру этих объектов на макромолекулярном и субклеточном уровнях.

   После выпуска первой промышленной модели просвечивающего (трансмиссионного) электронного микроскопа  электронная микроскопия прошла большой, путь развития и позволила перейти на качественно новый уровень изучения материи. Электронная микроскопия нашла широкое применение в морфологии, микробиологии, вирусологии, биохимии, онкологии, медицинской генетике, иммунологии. Благодаря электронная микроскопия раскрыта субмикроскопическая структура клеток, открыт ряд неизвестных ранее клеточных органелл, таких как лизосомы, рибосомы, эндоплазматический ретикулум, микротрубочки, цитоскелет, структуры, специфичные для отдельных видов клеток ( Клетка). Электронная микроскопия  позволила понять многие тонкие механизмы развития болезней, в т. ч. на ранних этапах их возникновения, еще до появления четкой клин, симптоматики.

     Электронная микроскопия все шире применяется для ранней диагностики- заболеваний, а также для выявления этиологии инф. процессов. Ее используют в онкологии для определения гистогенеза опухолей, что имеет важное значение в лечении и прогнозе онкол. заболевания. В нефрологии исследование с помощью Э. М. материала, полученного при пункционной биопсий, позволяет выявить ранние морфол. изменения структур почек, диагностировать форму гломерулонефрита  и т. п. При электронная микроскопия пунктатов печени удается провести дифференциальную диагностику гепатитов ( Гепатит), гепатозов  и других заболеваний печени, определить активность процесса и нередко его этиологию.

    Электронная микроскопия в сочетании с другими методами, напр. с авторадиографией, гистохимическими, иммунологическими методами, обусловило появление электронной авторадиографии, электронной гистохимии, иммунной электронной микроскопии (электронной иммуноморфологии) и др. Это позволило значительно расширить информацию, получаемую с помощью электронная микроскопия, наблюдать структурное выражение течения биохим. процессов в клетке, что, в свою очередь, подтвердило один из основных методологических принципов современной биологии — диалектическое единство структуры и функции.

   Электронная микроскопия требует специальной подготовки объектов изучения, от которой в значительной мере зависят возможности метода. В соответствии с целями исследования методика такой подготовки может быть различной. Однако непременным условием при любых электронно-микроскопических исследованиях является фиксация тканей или микробов с максимальным сохранением их прижизненного строения. Существует два принципиально различных способа фиксации — химический и физический; каждый из них имеет различные варианты.

   В электронная микроскопия, как правило, используют хим. фиксацию с помощью фиксаторов, обладающих стабилизирующими свойствами. Универсального для любых тканей фиксатора не существует, поэтому в зависимости от задач конкретного исследования применяют соответствующие фиксаторы. При выборе хим. фиксаторов исходят из их способности коагулировать белки (спирты, ацетон, некоторые кислоты, соли тяжелых металлов и др.) либо стабилизировать липиды и гели (четырехокись осмия, глутаровый альдегид, формалин, двухромовокислый калий и др.).

   Для исследования берут биопсийный материал или материал от трупа; человека или животных вскоре после наступления смерти. Существуют оптимальные сроки взятия различных тканей и клеток, обычно исчисляемые минутами. Чем раньше ткань помещают в фиксатор, тех М более достоверные данные получают о прижизненной структуре клеток. Фиксаторы обладают различной скоростью проникновения в ткань; от этого зависит возможная величина объекта исследования. Так, четырех окись осмия и глутаровый альдегид проникают в ткань на 0,1—0,5 мм примерно за 1—11/2 часа, что позволяет исследовать образец ткани объемом не более 1 мм3. В среднем время фиксации в хим. фиксаторах составляет 1—1Ч2 часа, но для некоторых тканей оно может быть увеличено до 4 час. или сокращено до 20—30 мин. В отдельных случаях допускается фиксация в течение 1 сут. Наибольшее распространение получила фиксация материала в глутаровом альдегиде с последующей дофиксацией в четырехокиси осмия. Глутаровый альдегид лучше, чемчетырехокись осмия, фиксирует белки, но хуже стабилизирует липиды, что и обусловливает использование обоих фиксаторов как дополняющих друг друга.

   Для избирательной фиксации отдельных субклеточных структур используют более специфические фиксаторы (перманганат калия, двухромовокислый калий и др.). Качество фиксации в значительной степени зависит от рН и осмотического давления фиксирующего раствора. Оптимальным является рН 7,2—7,4, что соответствует физиол. параметрам. Поэтому применяют буферные растворы . Чаще применяют фосфатные или какодилатный буферы. Физиол. осмотическое давление создают путем добавления осмотически активных веществ, напр. сахарозы или некоторых солей.

   Имеется несколько методов хим. фиксации: перфузионный, когда фиксатор вводят в ток крови; фиксация на месте, когда фиксатор вводят в ткань до ее иссечения; метод погружения иссеченных кусочков ткани в фиксатор. Для замедления аутолитических процессов, протекающих в иссеченных кусочках ткани до полной их фиксации, последнюю проводят при 2—5°.

   После фиксации необходимо осуществить обезвоживание ткани. Этот процесс должен быть относительно быстрым, постепенным и вместе с тем обеспечить максимально полное удаление воды из образца, что достигается проведением подлежащей исследованию ткани через батарею спиртов или ацетонов восходящей концентрации (от 30 до 100%) в течение 1 часа.

   Следующим важным этапом подготовки материала для электронная микроскопия является заливка (заключение) тканей в заливочные среды с целью получения блока, обладающего оптимальным сочетанием твердости и эластичности, позволяющим приготовить тонкий срез ткани (толщиной менее 100 нм), через который может пройти электронный луч. Первым заливочным материалом были метилметакрилат и бутилметакрилат. В наст. время они почти не применяются, т. к. токсичны и легко возгоняются под пучком электронов, что приводит к выраженным артефактам и загрязнению электронного микроскопа. Наиболее широко для заливки тканей используют эпоксидные смолы, в основном аралдит и эпон, часто применяемые совместно. Менее распространены полиэфирные смолы (вестопал ) и водорастворимые заливочные смеси, из которых чаще пользуются гликольметакрилатом и дуркупаном. Однако ни одна заливочная среда не является химически инертной и в какойто степени оказывает влияние на ткань; это необходимо учитывать при интерпретации результатов микроскопирования.

    В последние годы широкое применение нашла заливка в так наз. компаунды, т. е. в смесь определенных веществ: основы (мономера), отвердителя, придающего образующемуся полимеру прочность и твердость, пластификатора, обеспечивающего эластичность и упругость полимера, инициатора, диссоциирующего с образованием свободных радикалов, ускорителя, который, взаимодействуя с мономером, освобождает дополнительные активные радикалы, и катализатора, способствующего началу реакции полимеризации. В практике обычно используют компаунд, состоящий из основы, отвердителя, пластификатора и катализатора, роль которого может играть ускоритель или инициатор. Имеется достаточно большое количество способов пропитки ткани заливочными средами. Процесс пропитки обычно протекает при комнатной температуре или в термостате при 1° 30—48° в течение 15—48 час. Затем кусочки ткани переносят в маркированные желатиновые капсулы или специальные формы, наполненные заливочной смесью. Для полимеризации смеси капсулы на 48 час. помещают в термостат при 1° 60° либо оставляют в течение 24 час. при комнатной температуре, затем на 24 часа их помещают в термостат при 48° и еще на 24 часа — при

60°. В результате полимеризации образуется блок, обладающий соответствующими свойствами.

   Для получения ультратонких срезов толщиной 30—50 нм используются стеклянные или алмазные ножи. Алмазные ножи долговечнее стеклянных, но из-за высокой стоимости они не получили широкого распространения.

   К задней стороне ножа прикрепляют специальную ванночку и нож устанавливают на ультратом. В ванночку наливают 10% раствор этилового спирта или 10% раствор ацетона на дистиллированной воде. В подвижном держателе ультратома закрепляют блок с тканью. Резка блока осуществляется за счет поступательного движения стержня держателя, а подъем и опускание держателя относительно режущей кромки ножа обеспечиваются электронной схемой. Обычно вначале изготовляют так наз. полутонкие срезы толщиной 1 мкм, изучая которые, выбирают интересующий исследователя участок. Сориентировав соответствующим образом полутонкий срез и блок, проводят заточку блока с таким расчетом, чтобы на вершине образовавшейся пирамиды находился необходимый участок. Затем изготовляют ультратонкие срезы толщиной 30—50 нм. Из ванночки срезы переносят на металлические сетки.

   Для контрастирования срезов применяют вещества с большим атомным весом, такие как соли тяжелых металлов, интенсивно рассеивающие электроны. Ионы некоторых из этих веществ могут образовывать связи с кислородом и присоединяться к фосфатным группам нуклеиновых кислот; другие, особенно уранилацетат, помимо этого, действуют как универсальные красители на белки; свинец связывается с комплексами ткани и осмиевыми фиксаторами. Повышают контрастность и сами фиксаторы. Обычно проводят контрастирование ультратонких срезов или сочетают контрастирование кусочков и ультратонких срезов ткани, после чего их изучают в электронном микроскопе.

   Хим. методы фиксации и заливки материала имеют ряд недостатков. Так, при их использовании происходят хим. изменения макромолекулярной структуры клеток; при фиксации и обезвоживании клетки и ткани теряют некоторые вещества; при взаимодействии ткани, фиксатора и заливочной среды может меняться локализация внутриклеточных структур. Поэтому интенсивно разрабатываются физические методы приготовления ткани для электронная микроскопия и особенно для электронной гистохимии  и цитохимии. Большая часть этих методов основана на очень быстром замораживании кусочков ткани.

   При использовании метода замораживания—высушивания кусочки ткани помещают в хладоагенты (пропан, изопентан или фреон), охлажденные до t° —150°, и в клетках мгновенно прекращаются обменные процессы. При этом в ткани не успевают образоваться кристаллы льда, и поэтому субклеточные структуры не разрушаются, а вода переходит в стекловидное состояние. Затем в высоком вакууме (10~6—10~7 мм рт. ст.) происходит сублимация, после чего ткань специальным способом заливают в замороженные метакрилаты, аралдит или вестопал W. Однако не всегда удается достаточно быстро и равномерно заморозить ткань, а следовательно, полностью избежать образования кристаллов льда, которые при повышении температуры повреждают внутриклеточные структуры.

   Метод криоскалывания (замораживания—травления) позволяет избежать возникновения хим. реакций при обработке ткани. Фрагменты тканей замораживают в хладоагенте со скоростью, превышающей 1000° в 1 сек. Объект помещают в вакуум-ную камеру и тем или иным способом раскалывают или разрывают. На поверхность скола наносят платиноуглеродное покрытие (реплику). Затем реплику очищают от органических остатков в растворе сильного окислителя, промывают в воде и помещают на сеточку для электронной микроскопии. Для изучения поверхности изолированных клеток и тканей служит сканирующая (растровая) электронная микроскопия. Одним из основных условий приготовления объекта для сканирующей электронная микроскопия является необходимость сохранения соответствующего поверхностного натяжения клеток во избежание их деформации. Поверхность изучаемой ткани промывают сбалансированными изотоническими забуференными солевыми растворами или безбелковыми культуральными средами с рН 7,3—7,4, подогретыми до 1° 37°. Для выявления внутритканевых и внутриклеточных структур применяют механические, термические, химические и другие методы.

   Для электронная микроскопия микробов применяют сходные методы с учетом особенностей строения микробов, их размеров, осмотического давления и др. Так, особый подход осуществляется при электронная микроскопия вирусов. Изучение структуры вирусов затруднено из-за малых размеров и слабой рассеивающей способности вириона. На первых этапах электронная микроскопия вирусов эта трудность преодолевалась оттенением частиц при испарении тяжелых металлов в вакууме.

 

-->